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        激光共聚焦顯微鏡的工作原理介紹

        更新時間:2022-06-27      點擊次數:3227
           激光共聚焦顯微鏡是一種先進的細胞和分子生物學分析儀器,已被激光,電子照相機和計算機圖像處理等現代高科技手段所滲透,并與傳統的光學顯微鏡相結合。它以激光為光源,采用共軛聚焦原理和裝置,并使用計算機對觀察對象進行數字圖像處理觀察,分析和輸出。它的特征是對樣品進行斷層掃描和成像,對細胞的三維結構進行非侵入式觀察和分析。同時,使用免疫熒光標記和離子熒光標記探針,該技術不僅可以觀察固定的細胞和組織切片,還可以實時動態觀察和檢測活細胞的結構,分子,離子和生命活動。它越來越多地用于生物學和醫學領域,已經成為生物醫學實驗研究中重要的工具。
          激光共聚焦顯微鏡也是活細胞的動態觀察、多重免疫熒光標記和離子熒光標記觀察的有力工具。不僅可對活的或固定的細胞及組織進行無損傷的“光學切片”,進行單標記或雙標記細胞及組織標本的熒光定性定量分析;還可以用于活細胞生理信號,離子含量的實時動態分析監測,粘附細胞的分選,細胞激光顯微外科和光陷阱技術等??梢詿o損傷的觀察和分析細胞的三維空間結構。
          激光共聚焦顯微鏡的原理是用點光源照射試樣,在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑。光斑照射后發出的熒光被物鏡收集,沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡。光譜儀將熒光直接發送到檢測器。光源和探測器前面有一個針孔,分別稱為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同,約100-200納米;與焦平面上的光斑相比,兩者是共軛的,即光斑可以通過一系列透鏡同時聚焦在照明針孔和檢測針孔上。這樣,來自焦平面的光可以會聚在檢測孔范圍內,而來自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外而無法成像。激光逐點掃描樣本,檢測到針孔后的光電倍增管也逐點獲得相應光點的共焦圖像,將其轉化為數字信號傳輸至計算機。整個焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上。
          每個焦平面圖像實際上是樣品的光學橫截面,這種光學截面總是具有一定的厚度,也稱為光學片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強,且非焦平面光被針孔過濾,因此共焦系統的景深近似為零。沿z軸掃描可實現光學斷層掃描,并在待觀察樣品的焦斑處形成二維光學切片。將X-Y平面(焦平面)掃描與z軸(光軸)掃描相結合,將連續層次的二維圖像進行累加,經專用計算機軟件處理,即可得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點上,使得聚焦平面外激發的熒光無法進入檢測針孔。
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