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激光共聚焦顯微鏡的基本觀察步驟

更新時間:2022-09-01      點擊次數:1392
  激光共聚焦顯微鏡是一種高分辨率的顯微成像技術。普通的熒光光學顯微鏡在對較厚的標本(例如細胞)進行觀察時,來自觀察點鄰近區域的熒光會對結構的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術的關鍵點在于,每次只對空間上的一個點(焦點)進行成像,再通過計算機控制的一點一點的掃描形成標本的二維或者三維圖象。在此過程中,來自焦點以外的光信號不會對圖像形成干擾,從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細節分辨能力。
 
  樣品制備是檢測前的關鍵步驟,樣品需要用熒光探針(單,雙和三)標記。標本可以是固定的或活組織,或固定或活的貼壁培養。細胞應在共聚焦特殊培養皿或蓋玻片,懸浮細胞,萼片或滴劑和蓋玻片上培養,覆蓋。樣品厚度約1~2mm,蓋玻片厚度應小于0.17mm,滑塊厚度應在0.8~1.2mm之間,表面光滑,厚度均勻,并且沒有明顯的干擾熒光。固定樣品通常用密封片密封,通常使用通過使用pH 8.5-9的PBS制備的甘油密封。
 
  根據實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察,基本步驟如下:
 
  (1)開啟儀器電源及光源:一般先開啟激光共聚焦顯微鏡和激光器,再啟動計算機,然后啟動操作軟件,設置熒光樣品的激發光波長,選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管檢測器能得到足夠的信號結果。
 
  (2)設置相應的掃描方式:在目視模式下.調整所用物鏡放大倍數,在顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式,調整雙孔針和激光強度參數,即可得到清晰的共聚焦圖像。
 
  (3)獲取圖像:選擇合適的圖像分辨率,將樣品完整掃描后,保存圖像結果即可。
 
  (4)關閉儀器:儀器測定樣品結束后,先關閉激光器部分,計算機仍可繼續進行圖像和數據處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統,則應該在激光器關閉后,待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。
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